摘要：腸道病毒71型(enterovirus 71，EV71)感染嚴重危害兒童生命安全。其致病機理尚未完全明確。EV71感染既可以激活模式識別受體誘導機體的固有免疫應答，病毒自身也進化出獨特的機制逃避固有免疫的殺傷。此外，固有免疫應答也與EV71致病機理、臨床特點密切相關。本文就以上方面的最新研究進展進行綜述及討論。

　　關鍵詞：醫(yī)學期刊投稿,腸道病毒71,固有免疫,信號轉導,Ⅰ型干擾素,細胞因子

　　腸道病毒71型(enterovirus 71，EV71)是除脊髓灰質炎病毒外最重要的嗜神經型病毒之一。主要感染學齡前兒童，臨床表現輕重不一，從輕微的手足口病或皰疹性咽峽炎，到無菌性腦膜炎、腦炎、肺水腫和死亡[1]，目前尚無有效的藥物和預防手段。EV71引起疾病不同臨床表現的機制至今尚不清楚，推測與EV71感染導致異常的免疫反應有關。動物機體對病毒感染的免疫應答分為固有免疫應答和適應性免疫應答兩個層次。其中，固有免疫應答不但是機體抵抗病毒侵染的第一道防線，而且負責啟動和調節(jié)機體適應性免疫，在整個抗病毒免疫反應中發(fā)揮著十分重要的作用[2]。現就EV71感染宿主固有免疫應答的研究進展綜述如下。

　　1 固有免疫與病毒感染

　　固有免疫也稱天然免疫，是宿主防御病原體入侵的首道屏障。主要通過胚系編碼的模式識別受體(PRRs)識別病原微生物保守的相關分子模式(PAMPs)，實現對外來病原體的早期識別，進而啟動固有免疫的效應機制。病原體入侵宿主，PRRs迅速激活，通過特異的信號級聯(lián)反應活化轉錄蛋白，從而誘導靶基因、促炎細胞因子、Ⅰ型干擾素(Ⅰ型IFN，INF-α/β)等的表達，誘導感染部位產生炎癥反應，吸引并激活巨噬細胞(MC)和樹狀突細胞(dDCs)等免疫細胞，從而清除病原微生物;同時上調抗原遞呈細胞(APC)表面共刺激分子的表達，誘導T或B淋巴細胞活化、增殖、分化為效應T或B細胞，產生病原特異性的適應性免疫應答[3]。固有免疫和適應性免疫在感染的各個階段協(xié)同作用，最終清除入侵的病原微生物。

　　病毒釋放的PAMPs主要是核酸類物質，包括病毒基因組DNA、單鏈RNA(ssRNA)、雙鏈RNA(dsRNA)、5'三磷酸RNA和表面糖蛋白等[3]。宿主PRRs主要有四類[4]：Toll樣受體家族(TLRs)、RIG-Ⅰ樣解旋酶受體家族(RLRs)、核苷酸結合寡聚化結構域樣受體(NLRs)的一些成員，以及ERIS(STING/MITA)等蛋白質。PRRs分布在不同類型的細胞，不同的PRRs識別不同的PAMPs，并具有細胞特異性，激活不同的信號通路[5]。

　　已知哺乳動物有13種TLRs，表達在DCs、MC、淋巴細胞及其他細胞。TLR3、TLR7、TLR8、TLR9主要識別病毒DNA及RNA成分，TLR2、TLR4識別病毒糖蛋白[3]。RLRs有三個成員：視磺酸誘導基因蛋白Ⅰ(RIG-Ⅰ，DDX58，DEAD)、黑色素瘤分化相關基因5(MDA5、IFIH1)和遺傳學和生理實驗室蛋白2(LGP2)，RLRs在包括免疫細胞和非免疫細胞表達，可以識別細胞內RNA病毒成分[3]。另外兩類PRRs主要識別細胞內DNA[4]。

　　2 EV71感染的固有免疫識別

　　體外和動物研究的結果表明，小RNA病毒EV71與其他家族成員一樣，通常由TLRs與RLRs識別其核酸[3]。Gong X等[6]經RT-PCR證實，感染EV71的人單核細胞源巨噬細胞(MDMs)，TLR2、TLR7和TLR8的表達顯著增強，增強的IL-8和TLR2基因表達也在紫外線失活EV71感染的MDMs發(fā)現，分析很可能是細胞表面上的TLR2和病毒蛋白相互作用的結果，認為TLR2，TLR7和(或)TLR8參與了EV71相關分子模式的識別。雖未直接檢測到TLR3表達增加，但另一研究觀察到感染細胞中TLR3信號通路的關鍵轉錄因子干擾素調節(jié)因子3(IRF3)下調和干擾素刺激基因(ISG)磷酸化抑制，表明EV71和TLR3之間有關聯(lián)[7]。另外，EV71 3C蛋白酶(3Cpro)與RIG-Ⅰ相互作用，隨后破壞RIG-Ⅰ依賴的Ⅰ型IFN反應所需的RIG-Ⅰ-IPS-1復合體[8]，提示RIG-Ⅰ途徑可能參與識別EV71。最近，Kuo RL等[9]使用EV71 RNA作為激動劑，在基因敲除實驗中顯示MAD5表達減少，IRF3的活化與IFN-βmRNA表達相應降低，表明MDA5參與了EV71的PAMP識別。

　　PRRs基因的多態(tài)性也可能是EV71感染的危險因素。有國內的學者[10]檢測了87例有癥狀的EV71患者與57例無癥狀EV71感染對照組TLR3、RIG-Ⅰ以及MDA5的基因多態(tài)性，有序Logistic回歸分析顯示MDA5(rs1990760)的多態(tài)性與EV71感染的嚴重程度相關。提示通過調查EV71感染固有免疫機制，有可能識別高危嬰幼兒。

　　3 EV71感染宿主固有免疫信號轉導及應答

　　EV71與其他小核糖核酸病毒的RAN被免疫細胞識別后，通過招募特異接頭蛋白激活一系列信號級聯(lián)反應，誘導Ⅰ型IFN和促炎細胞因子的產生[3]。目前公認的大部分TLRs通過髓樣分化因子88(MyD88)途徑傳導信號，進而活化白介素1受體相關因子激酶(IRAKs)和腫瘤壞死因子受體相關因子6(TRAF6)，最終激活IRF7和核因子-κB(NF-κB)，誘導IFN-α等細胞因子的表達。而TLR3則通過干擾素TIR結構域銜接蛋白(TRIF)途徑(即MyD88 非依賴途徑)，一方面通過激活TBK1(TANK-binding kinase1)或IKK(IκB kinase)激酶復合體，活化轉錄因子IRF3或IRF7，最終誘導Ⅰ型IFN的表達;另一方面，通過激活IKKs活化NF-κB，最終誘導一系列炎癥因子的表達[4]。RIG-Ⅰ和MDA5識別雙鏈RNA后，激活下游的接頭蛋白IFN-β啟動刺激因子(MAVS，IPS-1、VISA或Cardif)，MAVS招募TRAF3或TRAF6形成功能復合體，從而進一步激活激酶TBK1/IKK-i或IKKs。TBK1/IKK-i使得IRF3或IRF7發(fā)生磷酸化，誘導Ⅰ型IFN的表達;而IKKs通過激活NF-κB，誘導一系列炎癥因子的表達[4]。 　　Ⅰ型IFN的早期感應及活動，使細胞迅速建立抗御病毒感染狀態(tài)，抑制病毒復制及傳播。然而，EV71誘導Ⅰ型IFN產生的研究結果并不一致。起初在小鼠模型中發(fā)現，早期使用重組IFN-αA，保護小鼠對抗EV71感染，而用抗IFN-α/β中和抗體預處理，則極大地提高了小鼠對EV71的易感性，死亡率及組織病毒載荷增加;雖然證實Ⅰ型IFNs對EV71感染的保護作用，但EV71接種沒有引起小鼠血清Ⅰ型IFNs增加[11]，也不能誘導人類MDMs釋放IFN-α[6]。臨床上，傳統(tǒng)的干擾素治療對EV71感染患者療效輕微。不過，最近一項研究證明EV71感染過程中可適度刺激INF的生產，但EV71誘導的INF或外源性INF治療不能有效觸發(fā)下游信號級聯(lián)反應以抑制病毒的復制[12]。對于這些矛盾的結果，目前學者們公認與EV71進化了機制以逃避宿主免疫殺傷有關。

　　細胞炎癥因子的分泌是構成防御病毒的第一道防線的重要部分，然而，也與EV71感染的發(fā)病機理密切關聯(lián)。臨床研究顯示，EV71感染伴自主神經功能失調患者IL-1β、IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的血漿水平升高[13]，并發(fā)腦炎與肺水腫患者IL-1β、IL-6水平顯著高于無并發(fā)癥的患者[14-16]。因此，升高的IL-6可能代表了IL-1β和TNF-α生物學作用的"網絡效應"。近年陸續(xù)報告EV71感染患者血液和腦脊液IL-10、IL-13、IFN-γ、IFN-γ誘導蛋白-10(IP-10)、單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)、MIG(IFN-γ誘導單核因子)、IL-1受體拮抗劑和粒細胞集落刺激因子(G-CSF)等增高，并與與EV71疾病嚴重程度相關[15-17]，說明由IL-6、IL-1β和TNF-α等介導的急性期蛋白和趨化因子激活可能會加劇病毒誘導的炎癥和病理學變化。Khong WX等[18]用抗IL-6抗體治療EV71感染的新生小鼠，與對照組相比顯著降低了死亡率和組織破壞程度，而且這些保護作用不依賴于病毒載荷。提示高水平IL-6可能與EV71感染過程中的發(fā)病率和死亡率存在因果關系，針對IL-6信號治療可能是治療重癥EV 71新的研究目標。

　　發(fā)育研究表明，固有免疫反應具有年齡依賴性的特點，有些特定模式在生命的早期被表達，而成人型模式在童年時才逐步建立[19]。比如嬰幼兒對感染信號的固有免疫應答中，產生較高水平的某些促炎細胞因子，特別是IL-6、IL-1β、IL-23，并表現出偏向Th2和Th17型輔助T細胞的反應，而抑制細胞內病原體重要的Th1型細胞因子IFN-α和IL-12p70水平則較低[20，21]。因此，最近有學者提出，由于免疫應答存在年齡依賴性，那么，控制病毒復制不力，或優(yōu)先產生病理性免疫應答，或兩者共同作用，可以解釋EV71感染嬰幼兒嚴重病例和死亡率較年長兒高的現象[19]。

　　4 EV71感染對固有免疫的調節(jié)

　　在DC等APC在通過PRRs啟動抗感染免疫應答的同時，病毒也通過進化出的各種機制來抑制PRRs介導的信號通路，從而逃避宿主對病毒的免疫殺傷。EV71編碼的的非結構蛋白3C、2A、2C都參與了此類調節(jié)。

　　4.1 EV71 3Cpro 幾乎參與了病毒復制過程的所有蛋白剪切，并針對宿主細胞固有免疫途徑的多個組件，導致I型IFN應答的抑制。3Cpro通過分解RIG-Ⅰ-IPS-1復合物和破壞IRF3核轉位阻斷RIG-Ⅰ信令[7];與TRIF結合，在半胱天冬酶抑制劑(Z-VAD-FMK)存在的條件下誘導其裂解，抑制其下游基因的表達[8];直接切割信號分子TRAF3[22]、IRF7 [23]、IRF9[24]。3Cpro還裂解滅活多聚腺苷酸化系統(tǒng)裂解刺激因子(CSTF-64)，抑制宿主前體mRNA 3'-末端加工和多聚腺苷酸化，可能會導致宿主細胞mRNA的成熟抑制[25]，有可能參與抵抗細胞抗病毒應答，包括抑制病毒誘導的IFNβ產生。

　　4.2 EV71 2Apro 另一個蛋白酶，新近研究證實，它以RIG-Ⅰ樣受體MDA5為水解目標[26]，并通過靶向切割在RIG-Ⅰ和MDA-5激活的信號轉導途徑中的關鍵接頭分子MAVS[27]，有效封鎖IFN-Ⅰ轉錄的上游，抑制Ⅰ型IFN的產生。Lu J等[12]還發(fā)現2PRO降低了干擾素受體1(IFNAR1)水平，阻止下游信號通路，從而抑制ISGs的活化。此外，2A pro可切割核孔蛋白62(Nup62)，導致核孔復合物跨膜轉運功能的障礙，因而，可導致細胞因子、IFN等抗病毒蛋白的合成受到抑制，從而無法有效的清除病毒，這可能是EV71逃避先天性免疫引起重癥病例或死亡病例的重要機制之一[28]。

　　4.3 EV71 2C 可直接與IKKβ相互作用，抑制IKKβ的活化和IκBα(IKK)的磷酸化/降解，從而抑制TNF-α誘導的NF-κB的激活[29]。以此調節(jié)宿主的固有免疫反應。

　　4.4其他 不久前劉穎等[30]用EV71(VR1432)感染Vero E6細胞后，進行干擾素刺激，發(fā)現細胞核內磷酸化轉錄激活因子1(STAT1)表達水平與胞質內相比明顯降低，表明EV71感染抑制Ⅰ型IFN信號通路中干擾素刺激基因因子3(IFN-stimulated gene factor 3，ISGF3，STAT1/STAT2/IRF9)的核轉位，從而影響干IFN效應途徑中抗病毒蛋白的表達。

　　由此可以見，EV71利用其3Cpro、2Apro、2C等，從基因轉錄水平到蛋白翻譯水平多層次的抑制參與抗病毒固有免疫的效應分子合成，從而使得病毒能夠突破固有免疫應答的防線對宿主造成進一步感染。針對這些環(huán)節(jié)的治療策略，有可能會改變疾病的預后。如蛋白酶抑制劑Rupintrivir對EV71 3Cpro有很好的抑制作用，體外用Rupintriviru與IFN-α組合處理EV71感染的細胞，對細胞病變效應的抑制作用比任何一個藥物單用顯著，顯示了強大的協(xié)同抗EV71活性[24]，為EV71感染治療展示了廣闊的前景。 　　綜上所述，EV71感染后固有免疫應答在抗病毒感染中起到了不可替代的重要作用，EV71也進化了機制逃避固有免疫的殺傷。但EV71與宿主固有免疫之間相互作用、以及固有免疫與適應性免疫協(xié)同完成對EV71的免疫清除的機制，目前尚未完全明確。探索這些機制，有助于闡明EV71致病和組織損傷機理，為疫苗研發(fā)以及制定治療疾病的新策略提供理論依據。

　　參考文獻：

　　[1]Sun LM，Zheng HY，Zheng HZ，et al.An enterovirus 71 epidemic in Guangdong Province of China，2008：epidemiological，clinical，and virogenic manifestations[J].Jpn J Infect Dis，2011，64(1)：13-18

　　[2]Akita S.Pathogen recognition by innate immunity and its signaling[J].Proe Jpn Acad Ser B Phys Biol Sei，2009，85(4)：143-156

　　[3]Akira S，Uematsus，Takeuchi O.Pathogen recognition and innate immunity[J].Cell，2006，124(4)：783-801

　　[4]孫輝，蔣爭凡.抗病毒天然免疫研究[J].中國科學：生命科學，2013，43(10)：815-823.

　　[5]Kuo RL，Kao LT，Lin SJ，et al.MDA5 Plays a Crucial Role in Enterovirus 71 RNA-Mediate