金銀花為常用大宗中藥材，來源于忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或待初開的花，自1963年為歷版《中國藥典》所收載。金銀花具有清熱解毒，疏散風熱之功效，用于癰腫疔瘡，喉痹，丹毒，熱毒血痢，風熱感冒，溫病發熱等[1]。

　　[摘要]為了探討硫磺熏蒸金銀花中斷馬錢子酸亞硫酸衍生物的生成機制，該研究采用柱色譜技術從未硫熏金銀花中目標性制備分離了斷馬錢子酸以進行后續模擬反應，斷馬錢子酸在有水條件下與二氧化硫反應生成了其亞硫酸衍生物，反應機制可能涉及了斷馬錢子酸的酯化反應或者是酸化開環后亞硫酸根對羰基的加成反應。該研究為支持硫磺熏蒸導致金銀花中斷馬錢子酸轉變成其亞硫酸衍生物提供了實驗依據。

　　[關鍵詞]藥學論文,硫磺熏蒸,金銀花,斷馬錢子酸

　　其化學成分包括揮發油、酚酸（主要為綠原酸及其衍生物）、環烯醚萜（斷馬錢子酸、馬錢苷、當藥苷及其衍生物）和黃酮類（蘆丁、木犀草苷等）。現代藥理研究表明金銀花具有廣譜抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、增強免疫力、解熱抗炎和利膽保肝等作用[2]。傳統的產地加工方法有曬干和陰干，現代加工方法有烘干、水蒸氣干燥、熱風干燥以及熱風-微波聯用等，1995年版《中國藥典》曾收載過硫磺熏蒸的處理方法，在2000年版之后的《中國藥典》均取締了該產地加工方法，然而，在某些主產區，有時仍會采用硫磺熏蒸以獲得良好的外觀色澤和防止蟲蛀。前期研究表明硫磺熏蒸能夠導致金銀花中環烯醚萜類主成分斷馬錢子酸1的含量降低，同時生成其亞硫酸衍生物2～4[3]，見圖1。斷馬錢子酸是一種分子結構中具有半縮醛羥基的環烯醚萜類成分，為金銀花含有的環烯醚萜類物質中的主要成分[4]，含量遠遠高于馬錢苷和當藥苷及其二聚產物，其含量的變化有可能會引起金銀花與環烯醚萜類成分相關的藥理活性的改變，譬如抗炎、抗病毒、保肝利膽等。為了進一步驗證硫熏金銀花中斷馬錢子酸亞硫酸衍生物的生成機制，該研究采用柱色譜技術從未熏金銀花中目標性制備斷馬錢子酸作為反應底物，將其在有水條件下與SO2反應，TLC和HPLC監測反應進程，基于LC-MS提供的質譜信息，與文獻數據比對，鑒定生成的化合物結構。

　　1材料

　　ShimadzuLC-20A高效液相色譜儀（日本島津）、Agilent1200-6130系列液相色譜-質譜聯用儀（AgilentTechnologies）、大容量冷凍離心機（DL-6MB，長沙英泰儀器有限責任公司）、SIGMA1-14小型離心機（Germany）、EYELAN-1100旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司）、裕華HH-S型水浴鍋（鞏義市裕華儀器有限責任公司），HZ85-1型磁力攪拌器（北京中興偉業儀器有限公司）、三口瓶、雙連球等。

　　色譜甲醇、色譜乙腈（Fisher，USA），娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司），其他試劑均為分析純。

　　新鮮的金銀花于2012年5月采自山東濟南，經中國中醫科學院中藥研究所王智民研究員鑒定為忍冬科植物忍冬L.japonica的花蕾。曬干樣品：新鮮金銀花攤開晾曬于太陽下至干燥即得；硫磺熏蒸樣品：新鮮金銀花攤開放于支架上的透氣金屬網篩中（不宜太厚），支架下端用鐵質器具裝入一定量硫磺粉末，點燃硫磺粉末出現藍紫色火焰，將整個裝置用塑料布密封，使硫磺黃色煙霧充滿裝置，熏制過夜，熏制后的金銀花晾于陰涼處，陰干即得。

　　2方法與結果

　　2.1斷馬錢子酸的分離制備

　　前期研究表明，曬干金銀花樣品中斷馬錢子酸的含量較高[3]，因此選擇曬干樣品進行該化合物的目標性分離制備。干燥的金銀花樣品（粉碎，311g）用17L50%乙醇滲漉提取，滲漉液回收溶劑至無醇味（約2300mL），離心（3500r・min-1，20min），上清液（約2100mL）上HPD-100大孔吸附樹脂柱，依次用5倍柱體積的水，10%，20%，30%，40%，95%乙醇洗脫，TLC和HPLC進行流分檢查，20%，30%乙醇洗脫部分富集斷馬錢子酸，合并后得10.3g固體粉末，上硅膠柱（300～400目，氯仿-甲醇-水15∶4∶0.4）進行粗分，ODS柱純化（10%甲醇洗脫），得到單體化合物（277mg）。經HPLC面積歸一化法檢測其純度為94%；經HPLC比對保留時間，在線紫外吸收以及質譜數據，確證該化合物為斷馬錢子酸。曬干金銀花50%甲醇超聲提取液和斷馬錢子酸在同一色譜條件下的HPLC圖見圖2。KromasilC18柱（4.6mm×250mm，5μm），流動相為1.4%甲酸水（A）和乙腈（B），梯度洗脫（0～20min，3%～8%B；20～45min，8%～15%B；45～60min，15%～24%B；60～70min，24%～40%B），檢測波長254nm，流速1mL・min-1，進樣量10μL，柱溫30℃。

　　2.2斷馬錢子酸在有水條件下與SO2反應

　　新鮮的金銀花經硫磺熏蒸后斷馬錢子酸1大部分被破壞，生成其亞硫酸衍生物2～4[3]，推測是斷馬錢子酸結構中的半縮醛基團與熏蒸過程中硫磺燃燒產生的SO2在有水的條件下發生反應所致；同時通過2007，2012年采集制備的硫磺熏蒸金銀花樣品的HPLC圖比對發現，在不同批次樣品中化合物2～4的含量比例不同[3，5]，推測是熏蒸過程中斷馬錢子酸與SO2接觸程度不同。因此，開展了以下實驗進行驗證。

　　2.2.1反應1Na2S2O3溶液（3mol・L-1）與H2SO4（3mol・L-1）水浴40℃反應生成的SO2氣體通入裝有20mL水的三角瓶中，待檢測到水溶液呈酸性（pH=1）時加入斷馬錢子酸固體粉末20mg，磁力攪拌器不斷攪拌，使之混合均勻，密封保溫放置15h，回收溶劑至干，甲醇復溶，按照2.1項下的HPLC條件進行檢測，產生了化合物2，3，見圖3。2.2.2反應2在斷馬錢子酸水溶液（1g・L-1）中通入由Na2S2O3溶液（1mol・L-1）與H2SO4（3mol・L-1）水浴40℃生成的SO2氣體，每隔1h取樣200μL，按照2.1項下的HPLC條件進行檢測，反應底物斷馬錢子酸與產物的HPLC圖見圖4，兩者峰面積隨時間的變化見圖5，5h后斷馬錢子酸完全轉化成為化合物2。

　　2.2.3反應3在斷馬錢子酸水溶液（3g・L-1）中通入由Na2S2O3（固體）與H2SO4（濃）水浴40℃生成的SO2氣體，每隔2min取樣200μL，按照2.1項下的HPLC條件進行檢測，反應底物斷馬錢子酸與反應產物的HPLC圖見圖6，兩者峰面積隨時間的變化見圖7，2min后斷馬錢子酸完全轉化成為化合物2。

　　2.2.4亞硫酸衍生物的HPLC和LC-MS確認基于相同色譜條件下HPLC-DAD分析提供的保留時間和在線紫外全波長光譜，與文獻比對，反應1生成了亞硫酸衍生物2，3。由于化合物2非常不穩定，在回收去除溶劑的過程中會轉變為脫SO2的產物（tR=46～48min），反應2和3采用反應后直接進行HPLC分析，只檢測到化合物2生成。除了保留時間和在線紫外光譜，負離子模式下的液質聯用分析也提供了化合物2的準分子離子峰455[M-H]-和911[2M-H]-以及碎片離子峰373[M-SO2-H2O-H]-，與文獻數據一致[3]。

　　3討論

　　斷馬錢子酸是一種分子結構中具有半縮醛羥基的環烯醚萜類成分，曾經從忍冬科金銀花L.japonicaThunb.、藍果忍冬L.coeruleaLinn.和長白忍冬L.ruprechtianaRegel等植物中分離得到，在不同批次曬干和硫熏金銀花中的質量分數分別為0.79%～2.63%，0.20%～1.25%（未發表數據），為金銀花中環烯醚萜類物質中的主要成分，其含量的變化有可能會引起金銀花與環烯醚萜類成分相關的藥理活性的改變，比如抗炎、抗病毒、保肝利膽等。由于該物質水溶性強，缺少市售對照品的供應，本研究探索了從曬干金銀花中富集、制備該成分的工藝流程，能夠實現快速、批量制備該物質，為后續反應進行提供了物質保障。

　　Braverman等報道了硫熏食品中普遍存在SO2與糖類物質的反應，與開鏈醛糖反應涉及了亞硫酸根對羰基的加成反應，而與環狀半縮醛糖類的反應涉及酸脫羥基醇脫氫的酯化反應[6-7]。在2.2.1項中，斷馬錢子酸粉末加入到SO2的水溶液中，固體粉末在溶解的過程中即與亞硫酸反應，產生了化合物2和3，說明此過程既有半縮醛羥基的酯化反應，也有斷馬錢子酸先水解后產生開鏈醛糖中間體，然后涉及亞硫酸根對羰基的加成反應，推測的反應歷程見圖8。2.2.2和2.2.3項表明，若將斷馬錢子酸先溶于水，然后不間斷通入SO2氣體，只有化合物2產生，說明斷馬錢子酸在酸性環境中不穩定，易發生水解，內酯環開裂，與亞硫酸的反應只涉及了上述第二種反應歷程；并且反應完全受控于SO2氣體的通入速度和量。硫代硫酸鈉與稀硫酸反應時，SO2產生緩慢，斷馬錢子酸與亞硫酸反應完全需經歷5h；硫代硫酸鈉與濃硫酸反應時，SO2產生迅速，斷馬錢子酸與亞硫酸反應完全僅需要2min。

　　在斷馬錢子酸與亞硫酸的反應中，未檢測到硫熏金銀花中另外一個主要衍生物4的生成，推測其可能的原因有二：①新鮮的金銀花在硫磺熏蒸過程中，復雜的組織環境和豐富的酶系統使化合物2或

　　3進一步甲酯化產生了化合物4，而該研究采用斷馬錢子苷與SO2水溶液反應，不能完全反映硫磺熏蒸金銀花的復雜過程；②金銀花中含具有開鏈醛基的化合物開鏈馬錢子苷，它在硫熏過程中與亞硫酸發生加成反應，產生化合物4。

　　新鮮的金銀花含水量較大，經過硫磺熏蒸而富含亞硫酸，其中的主要環烯醚萜類成分斷馬錢子酸在酸性環境中不穩定，與亞硫酸反應生成其相應的衍生物，該研究為揭示上述硫磺熏蒸機制提供了進一步的實驗依據。

　　近年來越來越多的研究表明硫磺熏蒸不僅導致二氧化硫殘留量超標，而且能夠改變其中的化學成分及其生物活性，比如白芍熏蒸導致芍藥苷和苯甲酰芍藥苷含量降低，生成其相應的亞硫酸衍生物[8-9]，生曬參熏蒸導致人參皂苷含量降低，生成其亞硫酸鈉衍生物[10]，白芷熏蒸導致其中取代的呋喃香豆素水解成苷元[11]，菊花熏蒸導致黃酮苷水解成其相應苷元[12]等。本研究為開展上述其他中藥硫磺熏蒸導致化學變化的反應機制研究提供了參考。

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