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藥劑師論文投稿川芎藥材中5種藥效成分的含量

所屬欄目:藥學(xué)論文 發(fā)布日期:2014-06-14 16:00 熱度:

  川芎LigusticumchuanxiongHort.為傘形科藁本屬多年生草本植物,以根莖入藥,味辛、性溫,具有活血行氣、祛風(fēng)止痛等功效[1]。川芎的主要藥效成分包括阿魏酸、總生物堿、內(nèi)酯類(lèi)化合物、揮發(fā)油和酚性成分等物質(zhì)[2-3]。

  [摘要]該文建立了HPLC同時(shí)測(cè)定川芎藥材中阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯含量的方法。用40%乙醇提取樣品中的藥效成分,采用SymmetryC18(4.6mm×250mm,5μm)色譜柱,0~5min,乙腈-甲醇-1%冰醋酸(20∶40∶40),5~30min,乙腈-甲醇-1%冰乙酸(60~100∶0∶40~0)為流動(dòng)相,流速lmL・min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)0~4.3min,321nm,4.31~30min,275nm,柱溫35℃,進(jìn)樣體積10μL,應(yīng)用安捷倫1100系列液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。5種藥效成分的分離效果良好,在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均大于0.99,加樣回收率(n=6)均在94.44%~103.1%。該方法應(yīng)用于研究都江堰產(chǎn)區(qū)(海拔600m左右)不同采收期對(duì)川芎阿魏酸和4種內(nèi)酯類(lèi)物質(zhì)含量的影響,試驗(yàn)在4月15日(栽后245d)至5月30日(290d)內(nèi)設(shè)置了10個(gè)采收期,發(fā)現(xiàn)5種藥效成分的含量與采收期(栽后天數(shù))均呈二次或三次函數(shù)關(guān)系,隨著采收期的推遲而先增后減,阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯的含量在栽后260~265d(4月30日至5月5日)最高。

  [關(guān)鍵詞]藥劑師論文投稿,川芎,HPLC,采收期,含量

  目前川芎的質(zhì)量評(píng)價(jià)主要以《中國(guó)藥典》2010年版(一部)的質(zhì)量規(guī)范為標(biāo)準(zhǔn),對(duì)川芎性狀、阿魏酸的含量(≥0.1%)、水分(≤12%)、總灰分(≤6%)、酸不溶性灰分(≤2%)、浸出物(≥12%)做了相關(guān)規(guī)定[1]。僅以阿魏酸一種藥效成分來(lái)評(píng)價(jià)川芎品質(zhì)的高低有失偏頗,作者一致認(rèn)為加之其他藥效成分綜合評(píng)價(jià)更為合理。如今測(cè)定阿魏酸單一成分含量的方法較多[4-9],也有單一測(cè)定藁本內(nèi)酯的方法[10],或阿魏酸與川芎嗪、阿魏酸與藁本內(nèi)酯2種成分同時(shí)測(cè)定的方法[11-12],還有一些有關(guān)成分測(cè)定和川芎指紋圖譜建立的方法[5-6,13-16],總之,這些方法只是單一成分及少數(shù)成分的定量測(cè)定,或是指紋圖譜中沒(méi)有確定具體成分、結(jié)構(gòu)及藥效作用,只是對(duì)所測(cè)的材料確定了共有峰的數(shù)量及相對(duì)面積大小(不能代表藥材中的真實(shí)含量),且存在耗時(shí)較長(zhǎng)和溶液消耗較多的缺點(diǎn),均不利于對(duì)川芎藥材品質(zhì)的綜合評(píng)價(jià),需要建立一套能同時(shí)測(cè)定多種藥效成分的快捷、高效而可靠的分析方法,以便全面、正確地綜合評(píng)價(jià)川芎藥材的品質(zhì)。

  另外,不同的采收期對(duì)川芎的品質(zhì)影響較大,蔣桂華和饒凡[17-18]等對(duì)川芎的采收期有過(guò)研究,遺憾的是其涉及的采收期較少或只測(cè)定阿魏酸、生物堿和揮發(fā)油3個(gè)指標(biāo)的含量,不足以篩選川芎的最適采收期;近年來(lái),隨著種植結(jié)構(gòu)和耕作制度的改變,川芎的收獲期逐漸提前,位于四川彭山縣的川芎產(chǎn)區(qū)也是雜交水稻的制種區(qū),為保證制種水稻提前栽秧,川芎的采收期提前到了4月上中旬;位于都江堰和彭州市的川芎主產(chǎn)區(qū),主要實(shí)行的是川芎-水稻輪作制,為了提高水稻產(chǎn)量,所選用水稻品種的生育期呈延長(zhǎng)之勢(shì),也在一定程度上影響了川芎的適時(shí)收獲。因此,系統(tǒng)研究川芎采收期特別是早收對(duì)川芎品質(zhì)的影響可為川芎的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

  本文建立了HPLC同時(shí)測(cè)定川芎藥材中阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯含量的方法,為川芎藥材及相關(guān)產(chǎn)品的品質(zhì)評(píng)價(jià)提供新的方法參考,同時(shí)研究川芎采收期對(duì)川芎品質(zhì)的影響對(duì)川芎的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)栽培及川芎-水稻輪作制度有重要意義。

  1材料

  安捷倫1100LC系列液相色譜儀,ChemStation化學(xué)工作站、VWD檢測(cè)器;CAP225D電子天平(德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司),SB-5200DTD超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

  試驗(yàn)材料培養(yǎng)于川芎藥材采收期試驗(yàn)田,川芎苓種來(lái)自都江堰市三江鎮(zhèn),2011年8月10日栽種在都江堰市石羊鎮(zhèn)廣益村試驗(yàn)田,土地平整,地力均一,pH為5.83,堿解氮58.34mg・kg-1,速效磷114.27mg・kg-1,速效鉀42.31mg・kg-1,有機(jī)質(zhì)23.82g・kg-1。試驗(yàn)采用單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),設(shè)置10個(gè)采收期,分別為2012年4月15日(栽后245d,下同)、2012年4月20日(250d)、2012年4月25日(255d)、2012年4月30日(260d)、2012年5月5日(265d)、2012年5月10日(270d)、2012年5月15日(275d)、2012年5月20日(280d)、2012年5月25日(285d)和2012年5月30日(290d)。重復(fù)3次,共30個(gè)處理,試驗(yàn)小區(qū)面積為20m2。施肥[19]、密度[20]及其他栽培管理措施保持小區(qū)間一致。

  甲醇(HPLC級(jí))和乙腈(HPLC級(jí))購(gòu)買(mǎi)于賽默飛世爾科技股份有限公司,乙醇(HPLC級(jí))和冰乙酸(AC級(jí))購(gòu)買(mǎi)于成都科龍化工試劑廠,超純水由娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)代替,標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品阿魏酸和藁本內(nèi)酯購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)食品藥品檢定研究院,洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H和洋川芎內(nèi)酯A購(gòu)于四川省中藥標(biāo)準(zhǔn)中心。

  2方法與結(jié)果

  2.1色譜條件

  SymmetryC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),流動(dòng)相為0~5min,乙腈-甲醇-1%冰醋酸(20∶40∶40),5~30min,乙腈-甲醇-1%冰乙酸(60~100∶0∶40~0);流速lmL・min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)0~4.3min,321nm,4.31~30min,275nm;柱溫35℃,進(jìn)樣體積10μL。2.2對(duì)照品溶液的制備

  分別準(zhǔn)確稱(chēng)取阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯等5種對(duì)照品32.000,50.000,50.000,50.000,100.000mg,用甲醇定容到100mL,搖勻,即得對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。分別準(zhǔn)確吸取一定量的上述儲(chǔ)備液于10mL量瓶中,用40%乙醇稀釋至刻度,搖勻,即得到0,3.2,6.4,12.8,19.2,25.6,32.0,64.0mg・L-1的阿魏酸對(duì)照品溶液0,25,50,100,200,300,400,500mg・L-13種洋川芎內(nèi)酯(I,H和A)對(duì)照品溶液和0,0.050,0.100,0.200,0.300,0.400,0.500,1.000g・L-1的藁本內(nèi)酯對(duì)照品溶液。

  2.3供試品溶液的制備

  2.3.1回流提取法取川芎樣品0.5g,精密稱(chēng)定,置于圓底燒瓶中,精密加入40%乙醇50mL,稱(chēng)重,加熱回流提取30min,放冷,再稱(chēng)定質(zhì)量,用40%乙醇補(bǔ)足失重,搖勻,靜置,取上清液,濾過(guò),續(xù)取濾液,0.45μm微孔濾膜濾過(guò),注入高效液相色譜儀,見(jiàn)圖1。

  2.3.2超聲提取法取川芎樣品0.5g,精密稱(chēng)定,置于圓底燒瓶中,精密加入40%乙醇50mL,稱(chēng)重,超聲提取30min(200W,40℃),放冷,再稱(chēng)定質(zhì)量,用40%乙醇補(bǔ)足失重,搖勻,靜置,取上清液,濾過(guò),續(xù)取濾液,0.45μm微孔濾膜濾過(guò),注入高效液相色譜儀,見(jiàn)圖1。

  結(jié)果表明加熱回流法與超聲波法對(duì)提取川芎藥材中的阿魏酸和洋川芎內(nèi)酯H的含量差異顯著,超聲法提取效果更佳,其余3種內(nèi)酯類(lèi)物質(zhì)的含量差異不顯著,由于超聲波法對(duì)藥效成分的提取操作更加簡(jiǎn)便,且效率更高,在工作過(guò)程中放出的熱量更少,故本文選用超聲波優(yōu)化提取法[21]作為提取川芎藥材中上述5種主要藥效成分的方法。

  2.4方法學(xué)考察

  2.4.1線性關(guān)系精密吸取2.2項(xiàng)下稀釋的對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液10μL注入液相色譜儀,平行測(cè)定3次,取平均峰面積。以進(jìn)樣量(X,μg)為橫坐標(biāo),峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計(jì)算,得到阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯的回歸方程分別為Y=73.630X+1.888(R2=1.000),Y=33.922X-4.682(R2=0.999),Y=6.117X-3.739(R2=0.999),Y=4.664X+0.493(R2=0.999)和Y=9469.800X+4.622(R2=0.999),分別在0.049~64,0.785~500,2.334~500,0.188~500,0.025~1000mg・L-1線性關(guān)系良好。

  2.4.2精密度試驗(yàn)精密吸取2.3.2項(xiàng)下提取的川芎樣品溶液10μL,連續(xù)進(jìn)樣8次,測(cè)得上述5種藥效成分的峰面積RSD均小于2%,表明儀器具有良好的精密度。

  2.4.3重復(fù)性試驗(yàn)取同一批川芎樣品6份,按2.3.2項(xiàng)下方法制備樣品溶液,吸取10μL注入液相色譜儀,結(jié)果顯示上述5種藥效成分峰面積的RSD分別為1.8%,0.90%,0.30%,0.44%,1.1%,表明超聲法提取重復(fù)性良好。

  2.4.4穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一樣品溶液,室溫放置,并分別于0,1,2,4,12,24,48h進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果顯示上述5種藥效成分峰面積RSD均小于1.6%,表明樣品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定。

  2.4.5回收率試驗(yàn)精密稱(chēng)取已知含量的樣品0.5g,共6份,精密稱(chēng)定并加入阿魏酸0.46mg、洋川芎內(nèi)酯(I,H和A)和藁本內(nèi)酯各0.5mg,按2.3.2項(xiàng)下方法制備樣品,加樣回收率按如下公式計(jì)算:回收率(%)=(測(cè)得量-樣品中量)/加入量×100。結(jié)果顯示上述5種藥效成分的平均加樣回收率,見(jiàn)表1,分別為103.1%,94.44%,96.61%,97.55%和95.22%。

  2.5樣品測(cè)定

  分別取不同采收期的川芎樣品,按2.3.2項(xiàng)下方法制備樣品溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,利用已建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯含量,見(jiàn)圖2。

  10次采收期樣品的平均阿魏酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.51mg・g-1,在260d時(shí)采收的樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,為2.94mg・g-1,比平均含量高17.1%,顯著高于除255d之外的其他8個(gè)采收時(shí)期,與255d采收的川芎阿魏酸含量差異在0.05水平時(shí)不顯著,在245,285,290d采收的阿魏酸含量最低,分別比平均含量低21.8%,4.1%,12.1%,而最高含量比最低含量高出了42.7%。洋川芎內(nèi)酯Ⅰ的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.58mg・g-1,270d時(shí)采收的樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,達(dá)0.70mg・g-1,比平均含量高20.69%,顯著高于其他各采收期的含量,290d采收時(shí)的洋川芎內(nèi)酯Ⅰ質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低,僅0.44mg・g-1,比270d時(shí)采收的樣品含量低59.1%。245,260d時(shí)采收的樣品洋川芎內(nèi)酯H質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,分別為2.19,2.15mg・g-1,在α=0.05水平時(shí)與其他各采收期的樣品含量差異顯著,除245d采收的樣品外,隨著采收期推遲其含量呈先增加后降低的現(xiàn)象,290d采收時(shí)的洋川芎內(nèi)酯H質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低,僅1.25mg・g-1,比260d采收的樣品含量低67.8%。洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在260d采收時(shí)最高,分別為15.21,31.35mg・g-1,與其他各采收期樣品的含量差異顯著,290d采收時(shí)其含量均最低,分別比最高含量低63.0%,35.0%。隨著采收期的推遲,川芎藥材中5種主要藥效成分的含量呈先增加后減小的變化趨勢(shì),其含量與采收期均呈二次或三次函數(shù)關(guān)系,并建立了相關(guān)的數(shù)學(xué)模型。通過(guò)上述5種藥效成分的含量與采收期的數(shù)學(xué)模型可知,早收和晚收均不利于提高川芎藥材的品質(zhì),255~270d期間采收川芎藥材的阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I和藁本內(nèi)酯的含量最高,250~260d期間采收川芎藥材的洋川芎內(nèi)酯H和洋川芎內(nèi)酯A的含量最高。綜合上述5種主要藥效成分含量和實(shí)際生產(chǎn)情況的角度來(lái)分析,260~265d為最佳采收時(shí)期,此時(shí)川芎生長(zhǎng)最旺盛,隨后開(kāi)始逐漸衰老,藥效成分的含量慢慢降低。

  3討論

  3.1HPLC同時(shí)測(cè)定川芎5種藥效成分含量的方法

  中藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)正向快速、高效、樣品前處理簡(jiǎn)單、高重復(fù)性、低成本、容易操作的方向發(fā)展。HPLC是中藥材及中藥飲片品質(zhì)評(píng)價(jià)常用的方法,在川芎上常被用于構(gòu)建指紋圖譜[5-6,13-16]來(lái)評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地和不同品種的藥材的品質(zhì),但一般沒(méi)有具體藥效成分的含量;也有一些測(cè)定阿魏酸、川芎嗪、揮發(fā)油、香草醛、內(nèi)酯類(lèi)等單一成分或其中2~4種成分測(cè)定方法方面的報(bào)道[4-12],由于同時(shí)測(cè)定的成分少,測(cè)定的效率不高,至今鮮見(jiàn)同時(shí)測(cè)定阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯等多種成分方面的研究。

  同時(shí)對(duì)色譜溶劑(乙腈和甲醇)與不同濃度的乙酸和水組成的流動(dòng)體系(甲醇-水、甲醇-乙酸、乙腈-水、乙腈-乙酸和甲醇-乙腈-乙酸等)、柱溫(25,30,35,40,45℃)和流速(0.7,0.8,0.9,1.0,1.1,1.2mL・min-1)等單變量(因素)試驗(yàn),優(yōu)化出了HPLC同時(shí)測(cè)定阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯含量,即選用流動(dòng)相為0~5min,乙腈-甲醇-1%冰醋酸(20∶40∶40),5~30min,乙腈-甲醇-1%冰乙酸(60~100∶0∶40~0),流速lmL・min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)0~4.3min,321nm,4.31~30min,275nm,柱溫35℃,進(jìn)樣體積10μL。本文通過(guò)對(duì)測(cè)定方法的考察,建立了高重復(fù)性、快速的川芎藥材中主要藥效成分含量的測(cè)定方法且線性、精密度、重復(fù)性和回收率均良好,洗脫時(shí)間僅為30min同時(shí)測(cè)定川芎藥材中5種重要的藥效成分,大大的提高了工作效率,同時(shí)也降低了測(cè)定成本,且所測(cè)定樣品的藥效成分含量與之前報(bào)道的結(jié)果一致[5,7-8,16,22-24],所以本測(cè)定方法可以全面應(yīng)用于川芎藥材的品質(zhì)評(píng)價(jià)。

  3.2采收期對(duì)川芎5種藥效成分含量的影響

  川芎的品質(zhì)不僅因產(chǎn)地[10]、品種而異,也受耕作方式[25]、施肥技術(shù)[22-24]等生產(chǎn)技術(shù)的影響。蔣桂華[17]、饒凡[18]等研究認(rèn)為采收期對(duì)川芎的品質(zhì)也有較大影響,但前者研究的時(shí)期是5月20日及其前后10d共3個(gè)時(shí)期,且結(jié)果在年度和地點(diǎn)不盡一致;而后者研究的時(shí)間從頭年12月至次年6月,時(shí)間間隔過(guò)大,對(duì)生產(chǎn)上主要采收時(shí)間(5月上旬至中旬)分析不夠。本文采用單因素隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)方法,從4月15日(245d)起每5天采收1次直至5月30日(290d)止,共10個(gè)采收期,采用上述建立的方法,分析了都江堰產(chǎn)區(qū)(海拔600m左右)每個(gè)采收期樣品的阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯共5種藥效成分的含量,并建立了其與采收期的回歸關(guān)系,發(fā)現(xiàn)采收期對(duì)這5種成分均有顯著影響,隨著采收期的推遲,5種藥效成分的含量均呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì),采收過(guò)早過(guò)晚都會(huì)降低各藥效成分的含量,綜合考慮阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯的含量,確定最佳采收期為4月30日(260d)至5月5日(265d)。

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文章標(biāo)題:藥劑師論文投稿川芎藥材中5種藥效成分的含量

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