摘要：目的探討炮制因素對(duì)藥學(xué)甘草中藥學(xué)甘草苷和藥學(xué)甘草酸含量的影響。方法篩選適當(dāng)提取方法，采用HPLC-DAD技術(shù)，ZorbaxSB-C18ODS反向色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)，以0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸溶液和甲醇為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速1.0ml•min-1，柱溫30℃，檢測波長250nm和276nm。測定了同一產(chǎn)地、同一批次的藥學(xué)甘草和炙藥學(xué)甘草中藥學(xué)甘草苷和藥學(xué)甘草酸的含量。
　　關(guān)鍵詞：藥學(xué)甘草論文;藥學(xué)甘草苷論文;藥學(xué)甘草酸論文;炮制論文;高效液相色譜論文
　　藥學(xué)甘草系豆科植物藥學(xué)甘草(GlycyrrhizauraienxisFisch)的根及根狀莖，俗稱靈草、蜜甘、蜜草、國老、甜草等，性味甘平，能調(diào)和諸藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，是臨床上最常用的中藥之一。藥學(xué)甘草在中醫(yī)臨床應(yīng)用中有藥學(xué)甘草和炙藥學(xué)甘草之分，其中藥學(xué)甘草指生藥學(xué)甘草,為原藥材除去雜質(zhì)，洗凈、潤透切片、生用入藥者。炙藥學(xué)甘草又名炙草、蜜炙藥學(xué)甘草，為生藥學(xué)甘草片用蜂蜜拌勻，再炒至不粘手取出攤晾，然后入藥者[1]。
　　炮制是根據(jù)中醫(yī)藥理論，依照辨證施治用藥和藥物自身性質(zhì)以及調(diào)制、制劑的不同要求所采取的一項(xiàng)制藥技術(shù)，是中醫(yī)藥學(xué)的一大特色[2]。在古代方劑中藥學(xué)甘草與炙藥學(xué)甘草應(yīng)用區(qū)別明顯：藥學(xué)甘草性甘偏涼，長于瀉火解毒、化痰止咳;而藥學(xué)甘草經(jīng)蜜炙后味轉(zhuǎn)甘溫，以補(bǔ)脾和胃、益氣復(fù)脈力勝。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，炙藥學(xué)甘草能抗多種心律失常;藥學(xué)甘草和炙藥學(xué)甘草的調(diào)節(jié)免疫作用存在明顯的差異，蜜炙藥學(xué)甘草的調(diào)節(jié)免疫作用顯著強(qiáng)于藥學(xué)甘草。炙藥學(xué)甘草應(yīng)為臨床補(bǔ)氣用藥學(xué)甘草的最佳炮制品，可調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能[3]。由此可見，藥學(xué)甘草經(jīng)炮制后理化性質(zhì)發(fā)生變化，其性味功能也有所改變。我們以藥學(xué)甘草中最主要的2種有效成分藥學(xué)甘草苷(liquiritin)和藥學(xué)甘草酸(glycyrrhizicacid)為檢測指標(biāo)，采用HPLC-DAD法比較藥學(xué)甘草炮制前后這2種成分含量的變化，從化學(xué)成分角度來探討中藥炮制的合理性、科學(xué)性。
　　1儀器與試藥
　　1.1儀器ShimadzuLC-10A高效液相色譜儀(日本島津)，包括SCL-10AvpSystemController、SPD-M20ADAD二極管陣列檢測器、LC-10ADvp泵、FCV-10ALvp四元低壓梯度洗脫系統(tǒng)、LC-Solution色譜數(shù)據(jù)工作站;梅特勒托利多AE240電子天平(瑞士MettlerToledo公司);Millipore超純水機(jī);超聲波清洗器(型號(hào)SK250LH,上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)。甲醇(色譜純,美國J.T.Baker公司);水為超純水;其余試劑皆為分析純。
　　1.2試藥對(duì)照品藥學(xué)甘草苷(批號(hào)：06121824)及藥學(xué)甘草酸(批號(hào)：06110101)由上海同田生物科技有限公司提供。藥學(xué)甘草(批號(hào)：20071229;產(chǎn)地：甘肅)及炙藥學(xué)甘草(批號(hào)：20071229;產(chǎn)地：甘肅)藥材購自徐州醫(yī)藥股份有限公司中藥飲片廠，經(jīng)徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院杜長俊副主任中藥師鑒定為真品。藥學(xué)甘草和炙藥學(xué)甘草為豆科植物藥學(xué)甘草的干燥根及根莖的炮制加工品。樣品憑證保存于我科。
　　2實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果
　　2.1色譜條件色譜柱：ZorbaxSB-C18反向色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)，流速1.0ml•min-1，柱溫30℃，檢測波長分別為250nm和276nm。進(jìn)樣量：20μl，流動(dòng)相:A為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液，B為甲醇，用前超聲脫氣30min，洗脫程序見表1。記錄65min色譜圖，見圖1～3。理論塔板數(shù)按藥學(xué)甘草苷和藥學(xué)甘草酸峰計(jì)應(yīng)不低于4000。表1梯度洗脫程序
　　2.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取藥學(xué)甘草苷對(duì)照品3.68mg、藥學(xué)甘草酸對(duì)照品2.46mg，用70%甲醇水溶圖1藥學(xué)甘草提取液250nm處HPLC圖譜(1.藥學(xué)甘草苷;2.藥學(xué)甘草酸)
　　圖2炙藥學(xué)甘草提取液250nm處HPLC圖譜(1.藥學(xué)甘草苷;2.藥學(xué)甘草酸)
　　圖3對(duì)照品溶液250nm處HPLC圖譜(1.藥學(xué)甘草苷;2.藥學(xué)甘草酸)
　　液溶解并定容于5ml棕色容量瓶中，得藥學(xué)甘草苷0.736g•L-1及藥學(xué)甘草酸0.492g•L-1的0號(hào)混合對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液。從中精密量取適量，用流動(dòng)相配成藥學(xué)甘草苷濃度為0.368、0.184、0.092、0.046、0.0184、0.0092g•L-1及藥學(xué)甘草酸濃度為0.246、0.123、0.0615、0.03075、0.0123、0.00615g•L-1的1～6號(hào)混合對(duì)照品貯備液。
　　2.3供試品溶液的制備精密稱取藥學(xué)甘草粉末及炙藥學(xué)甘草粉末(過60目篩，烘干至恒重)各0.2g，置具塞錐形瓶中，精密加入20ml70%甲醇，稱定重量，室溫放置1h后超聲處理(功率250W，頻率40kHz)40min，取出錐形瓶擦干后放冷到室溫，再稱重，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，上清液經(jīng)0.45μm濾膜濾過，取續(xù)濾液供HPLC分析。
　　2.4方法學(xué)考察
　　2.4.1線性關(guān)系考察精密吸取“2.2”項(xiàng)下已制備的各不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液(0～6號(hào))20μl注入色譜儀，測定峰面積，以藥學(xué)甘草苷或藥學(xué)甘草酸濃度(g•L-1)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸,得直線回歸方程，見表2。表2線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=7)
　　2.4.2檢測限和定量限取0號(hào)混合對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用0.1%甲酸水溶液-甲醇(70∶30)依次稀釋制成一系列由高到低的梯度濃度溶液并進(jìn)樣分析，測定峰面積約為噪聲10倍(S/N=10)時(shí)的進(jìn)樣濃度為定量限(QOD)，測定峰面積約為噪聲3倍(S/N=3)時(shí)的進(jìn)樣濃度為檢測限(LOD)。結(jié)果藥學(xué)甘草苷和藥學(xué)甘草酸的QOD分別為0.0069mg•L-1和0.0077mg•L-1，LOD分別為0.0023mg•L-1和0.0031mg•L-1。
　　2.4.3精密度試驗(yàn)精密移取1號(hào)混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液20μl，重復(fù)進(jìn)樣6次(2次進(jìn)樣之間間隔約30min)，測定峰面積，結(jié)果藥學(xué)甘草苷平均峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)=0.498%，藥學(xué)甘草酸平均峰面積RSD=0.742%;精密移取1號(hào)混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液20μl，連續(xù)分析6天，每天進(jìn)樣1次，測定峰面積，結(jié)果藥學(xué)甘草苷平均峰面積RSD=1.67%，藥學(xué)甘草酸平均峰面積RSD=2.71%。結(jié)果表明儀器精密度良好。
　　2.4.4重現(xiàn)性試驗(yàn)取炙藥學(xué)甘草樣品6份，按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法處理，制成6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法測定，結(jié)果藥學(xué)甘草苷平均含量為0.09683g•L-1，RSD=1.83%;藥學(xué)甘草酸平均含量為0.1358g•L-1，RSD=2.36%。結(jié)果表明此方法重現(xiàn)性良好。
　　2.4.5穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一份炙藥學(xué)甘草樣品溶液。在配制后0、2、4、6、8、12、24h進(jìn)樣，測定峰面積，結(jié)果藥學(xué)甘草苷平均峰面積RSD=0.827%，藥學(xué)甘草酸平均峰面積RSD=0.964%。結(jié)果表明24h內(nèi)樣品溶液穩(wěn)定。
　　2.4.6回收率試驗(yàn)精密移取0.2ml已知藥學(xué)甘草苷及藥學(xué)甘草酸含量的炙藥學(xué)甘草樣品溶液9份，每3份分別精密加入藥學(xué)甘草苷濃度為0.1g•L-1及藥學(xué)甘草酸濃度為0.14g•L-1的混合對(duì)照品溶液0.16、0.20、0.24ml，按“2.1”項(xiàng)下方法同時(shí)測定藥學(xué)甘草苷和藥學(xué)甘草酸的含量，結(jié)果見表3、4。表3藥學(xué)甘草苷加樣回收率測定結(jié)果表4藥學(xué)甘草酸加樣回收率測定結(jié)果
　　2.5不同樣品中藥學(xué)甘草苷和藥學(xué)甘草酸含量測定取藥學(xué)甘草和炙藥學(xué)甘草樣品各6份，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下方法測定。統(tǒng)計(jì)分析：計(jì)量資料以±s表示，以t檢驗(yàn)比較組間差異，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，藥學(xué)甘草經(jīng)蜜炙后藥學(xué)甘草苷和藥學(xué)甘草酸的含量均增加(P<0.01)。表5不同樣品中藥學(xué)甘草苷和藥學(xué)甘草酸含量測定
　　3討論
　　3.1提取溶劑的選擇我們比較了80%氨性甲醇提取后酸化定容、80%甲醇、70%乙醇(中國藥典2005版測定藥學(xué)甘草苷的提取溶劑)、70%甲醇對(duì)藥學(xué)甘草苷和藥學(xué)甘草酸的提取效率及色譜峰峰型的影響，其中70%甲醇效果相對(duì)略好，又考慮到流動(dòng)相采用甲醇-0.1%甲酸水溶液，因此，采用70%甲醇冷浸超聲提取。
　　3.2檢測波長的選擇采用DAD檢測器，在完成色譜數(shù)據(jù)采集后，可在不同的提取波長下進(jìn)行定量分析。參考中國藥典2005版規(guī)定的藥學(xué)甘草苷和藥學(xué)甘草酸的檢測波長，再結(jié)合藥學(xué)甘草苷和藥學(xué)甘草酸的DAD全波長掃描圖譜，最終選擇276nm為藥學(xué)甘草苷的檢測波長，250nm為藥學(xué)甘草酸的檢測波長。
　　3.3流動(dòng)相系統(tǒng)的選擇藥學(xué)甘草的成分復(fù)雜，為盡可能地使藥學(xué)甘草成分達(dá)到較好的分離效果，我們對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了一系列優(yōu)化。流動(dòng)相方面，試驗(yàn)了乙腈-水[4]、甲醇-水、乙腈-甲醇-水等，發(fā)現(xiàn)當(dāng)流動(dòng)相中有乙腈時(shí)，出峰較晚的組分分離效果不佳，且乙腈試劑昂貴，毒性大，選用甲醇-水二元系統(tǒng)進(jìn)行分離測定，可使待測組分和干擾組分較有效分離。由于藥學(xué)甘草酸為有機(jī)弱酸，且易解離，峰形拖尾，因此，考慮在流動(dòng)相中加入一定量的酸作為抑制劑，之所以用甲酸而不用冰醋酸[1]、磷酸[4-5]、磷酸緩沖鹽等，是考慮到后續(xù)可直接采用已建立的流動(dòng)相條件進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析及對(duì)色譜柱的保護(hù)。總之，選擇0.1%甲酸水溶液-甲醇作為流動(dòng)相，簡單、經(jīng)濟(jì)、有效。
　　3.4固定相的選擇預(yù)實(shí)驗(yàn)考察了大連依利特HypersilODS2、大連依利特KromasilC18(250mm)、大連依利特KromasilC18(150mm)、大連依利特HypersilBDSC18、島津Shim-PackCLC-ODS、安捷倫ZorbaxSB-C18ODS等色譜柱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZorbaxSB-C18ODS色譜柱給出的藥學(xué)甘草苷和藥學(xué)甘草酸的峰形及分離度均較好。
　　3.5柱溫的選擇在確定固定相和流動(dòng)相的情況下，分別考察了25、30、35℃柱溫，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明30℃柱溫下峰形及分離度較好。
　　3.6炮制因素對(duì)藥學(xué)甘草苷和藥學(xué)甘草酸影響的分析為使測定結(jié)果更準(zhǔn)確地反映炮制因素引起的化學(xué)成分變化，我們選用了正在上市銷售的同一產(chǎn)地、同一批次的藥學(xué)甘草和炙藥學(xué)甘草藥材。檢測結(jié)果表明，炮制因素可顯著增加藥學(xué)甘草中藥學(xué)甘草苷和藥學(xué)甘草酸的含量。其原因可能是藥學(xué)甘草苷和藥學(xué)甘草酸熱穩(wěn)定性好，藥學(xué)甘草經(jīng)蜜炙后蜂蜜充分滲入藥學(xué)甘草組織內(nèi)部置換出部分水分，且蜂蜜覆蓋于藥學(xué)甘草表面能防止空氣中氧及二氧化碳與藥學(xué)甘草中有效成分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，有效延長了藥學(xué)甘草的貯藏時(shí)間。由此可推斷中醫(yī)用藥講究炮制，目的是利用多種輔料的助溶作用或成分結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，提高有效成分的檢出率，從而提高療效，改變適應(yīng)證。
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