自1981年在美國被發現以來，艾滋病(AIDS)就呈不斷蔓延的趨勢[1]。2017年全球共報告新發HIV感染180萬(140萬～240萬)，HIV感染者達3690萬人(3110萬～4390萬)[2]。2017年(2017年1月1日零時至12月31日24時)全國(不含港澳臺)共報告法定傳染病發病7030879例，死亡19796人，其中艾滋病死亡15251例(77.04%)[3]。目前艾滋病尚未有根治的方法和有效的疫苗，因此艾滋病的防治工作主要是控制艾滋病的傳播，以預防為主，普及艾滋病的檢測，盡早地發現感染者[4]。而HIV實驗室檢測技術則是開展艾滋病各項預防、治療以及干預措施的基本手段之一。HIV的實驗室檢測主要包括血清學檢測、淋巴細胞檢測和核酸檢測[5]。血清學檢測一般用于艾滋病常規篩查和確證實驗，檢測血清中HIV抗原或(和)抗體，易于自動化且成本較低[6]，但是不能應用于HIV感染者的治療及用藥監測。淋巴細胞檢測主要用于了解機體的免疫狀態、確定用藥治療時機及疾病分期、判斷治療效果和臨床并發癥等[7]，但是這種方法的特異性較低，僅作為艾滋病患者確證后的檢測手段，不能用于艾滋病的早期診斷。而核酸檢測由于靈敏度和特異性高，窗口期短[8](HIV感染者血漿中HIVRNA出現時間早，病毒感染后約10天，在血漿中病毒載量即達到核酸擴增技術可檢測出的水平)，因此可以用于艾滋病的早期診斷，并且其在臨床治療效果、耐藥性的監測及病程的監控、預測等方面均有廣泛的應用[9]。根據不同的應用場景，HIV核酸檢測可以分為：大型醫院、基層衛生服務機構(社區衛生服務中心、鄉鎮衛生院等)以及家庭檢測。

　　1大型醫院的HIV核酸檢測

　　目前臨床上很多大型醫院如三級醫院等都有分子生物學實驗室，能夠滿足HIV核酸檢測的環境及人員要求。在大型醫院，HIV的核酸檢測主要依賴于自動化或半自動化的大型儀器，能夠實現較高通量的核酸檢測，滿足大樣本量的需求，可分為定性和定量檢測。截至目前，通過我國藥品監督管理局醫療器械注冊且仍在有效期內的HIV核酸檢測試劑有11種(表1)，其中進口產品3項，國產8項。定性檢測主要用于艾滋病的早期診斷，常用的檢測試劑盒有歐盟批準生產的AbbottM2000HIV-1RNA/DNA定性檢測試劑，使用Taqman探針法進行檢測;美國食品與藥品監督管理局(FoodandDrugAdministration，FDA)批準的Gen-Probe公司生產的AptimaHIV-1RNA核酸定性檢測試劑在臨床中也有應用[10]，其檢測原理為轉錄介導的等溫擴增系統(transcriptionmediatedamplification，TMA)結合化學發光標記的探針雜交檢測，檢測的靶基因為HIV-1LTR和多聚酶基因。定量檢測可用于艾滋病的早期診斷、監測抗病毒治療效果及疾病進展。臨床上常用的定量檢測試劑包括美國羅氏分子診斷公司研發的RocheCobasTaqManv2.0和美國AbbottMolecular公司生產的AbbottRealTimeHIV-1檢測試劑盒。其技術主要基于實時熒光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR)的方法對血清中HIV核糖核酸/脫氧核糖核酸(RNA/DNA)進行定量分析，上述兩種試劑盒主要應用了Taqman水解探針法，自1996年美國PerkinElmer公司發明TaqMan技術以來[11]，該技術如今已經被廣泛應用到HIV基因檢測[12]。法國Biomerieux公司生產的NucliSENSEasyQHIV-1v2.0應用了分子信標技術，這種基于非水解探針的分子信標技術也是較常用的一種核酸檢測方法，在檢測HIV-1病毒載量時與TaqMan探針法具有較好的相關性和一致性[13-14]，但分子信標探針設計較為復雜且成本較高。實時熒光定量PCR技術與常規的PCR技術相比[15]，特異性更高，不僅能夠有效地解決PCR過程的污染問題，而且具有自動化程度高等特點。目前實時熒光定量PCR在市場上應用廣泛，我國常用國內外的實時熒光定量PCR試劑進行檢測。深圳凱杰公司、廣州達安公司等均已研發出HIV核酸診斷試劑投入市場[16]。美國SiemensHealthcareDiagnostics公司基于分支鏈DNA信號放大技術(branchedDNA，bDNA)研發了VER-SANTHIV-1RNAbDNA3.0檢測試劑盒。bDNA技術于1989年由美國Chiron公司研發[17]，基于特殊的分支鏈信號放大系統，靶標被捕獲探針捕獲后，與各級探針雜交，最后用與bDNA放大序列互補的堿性磷酸酶(AP)標記的寡核苷酸通過雜交與bDNA分子結合。通過對化學發光的強度的測定對靶標進行定量檢測[18]。由于反應過程不依賴于核酸擴增，因此不存在擴增產物的污染問題，這是該技術的一大優勢，但如何提高檢測的靈敏度是該技術的難點。同時該技術的缺陷在于信號放大探針在制備上難度較大且操作步驟過于繁瑣，限制了其在臨床檢測中的應用。上述試劑所需的配套儀器成本高、體積大，對操作人員的專業要求較高，適用于樣本量較大的大型中心醫院的檢測。根據國內外的相關數據及文獻報道，考慮到HIV檢測的特殊性，避免誤診，《全國艾滋病檢測技術規范(2015年修訂版)》中建議用5000拷貝/mL作為判斷結果的閾值，兩次定量檢測更有助于準確判斷結果[19]。對于評估抗病毒藥物療效和病程進展，同一病人宜使用相同試劑，有助于合理解讀病毒載量的變化。

　　2基層衛生服務機構的HIV核酸檢測

　　由于艾滋病復雜的病程及其難治性，艾滋病患者到大醫院診治的時間相對來說較為短暫，其大部分的時間是在家庭、社區中度過的，HIV的檢測也應當盡可能地拓展到整個社會中去，以基層衛生服務機構為核心開展HIV感染者的社區檢測，已成為迫在眉睫的社區衛生服務任務[20]。基層醫療衛生服務機構由于經費投入不足、醫務人員水平有限，適合使用價格低廉、操作簡便的一體化檢測設備，從而降低核酸檢測對實驗室及操作人員的要求。設備的各個樣本檢測模塊相互獨立，可以實現樣本的即到即檢。《“十三五”深化醫藥衛生體制改革規劃》中強調建立科學合理的分級診療制度，提升基層醫療衛生服務能力[21]。就HIV檢測而言，社區衛生服務中心等基層醫療機構由于存在場地及人員限制，大多不能進行常規的核酸檢測，而近年來全自動及集成化的HIV核酸即時檢測(pointofcaretesting，POCT)設備的發展，使得社區醫院及資源匱乏地區的HIV核酸檢測成為可能。傳統的PCR實驗一般都要進行樣本的裂解、核酸提取、純化及濃縮等繁雜的樣品制備過程，耗費時間久[22]。近幾年市場上興起的微流控芯片技術為實現HIV核酸的即時檢測提供了很好的發展方向。微流控芯片又稱芯片實驗室(Labonachip，LOC)[23]，是指在幾平方厘米大小的芯片上構建生物或化學實驗室。微流控技術具有所需樣品體積小、檢測效率高、使用成本低且具有良好的兼容性、有望實現便攜式檢測裝置等特點[24-25]。美國Cepheid公司開發了一款從樣品中核酸的提取到完成PCR檢測完全實現自動化的GeneXpert微流控核酸檢測系統，反應中大多數液體是以凍干的形式預先填充的，大大減少了樣品混淆和操作錯誤的機會。從樣本的制備到完成測試出檢測結果僅需要半小時，減輕了操作者的工作強度。其研發的HIV定性檢測試劑靶基因為HIV-1LTR區，可以對患者全血或者干血斑進行檢測，其檢測結果與AbbottM2000HIV-1realtime檢測試劑盒有較好的一致性[26]。Abbott公司的AlereqHIV檢測平臺只需要25uL外周血或血漿1h內完成多重實時PCR反應來檢測HIV-1(M/N)亞型，HIV-1(O)亞型和HIV-2型病毒。羅氏公司生產的CobasLiat使用微流控芯片技術，通過擠壓PCR反應試劑在三個擁有不同溫區的腔室內來回移動來實現PCR反應所需要的溫度循環，這種以空間上的溫度循環來取代時間上的溫度循環的方式極大了縮減了PCR所需的反應時間，可應用于艾滋病的快速檢測，但空間域PCR需要更多樣化的以及更大的微流控平臺[27]。另外，2014年劍橋大學研發的全自動SAMBA檢測平臺[28-29]可用于全血或血漿樣本的HIV核酸的快速檢測，其基于等溫擴增的原理，與AbbottRealTimeHIV-1檢測試劑盒的檢測一致性可達98%[30]。上述幾種可用于HIV即時檢測的微流控核酸檢測設備產品比較情況，詳見表2。這幾種HIV微流控核酸檢測可以解決基層衛生服務機構或資源匱乏地區的HIV現場檢測環境及人員限制的問題，使基層醫療單位具備開展核酸檢測的能力。但是其儀器與試劑成本均較高(以GeneXpert為例，一臺儀器價格約在90萬～120萬左右)，且產品缺乏市場規范和標準，因此目前沒有大范圍推廣.

　　3家庭檢測

　　HIV家庭檢測的私密性高，產品便攜且便于使用，在說明書的指導下即可完成操作，采樣過程簡單，檢測過程需要很少或不需要試劑、設備，結果判讀簡單，將是未來HIV檢測主要的發展方向之一。紙條檢測是最易于家庭使用的檢測方式，HIV抗原抗體檢測膠體金法已廣泛應用于艾滋病篩查實驗[31]，但是市場上HIV核酸檢測紙條檢測的相關應用較少。2012年，美國休斯敦萊斯大學的RebeccaR.Richards-Kortum團隊描述了一種紙條測定方法，該方法使用金納米顆粒探針和金增強溶液定量檢測擴增的HIVRNA[32]，檢測時間只需20分鐘，每個試劑盒成本約為0.80美元。核酸紙條檢測在HIV即時檢測方面有巨大的潛力，其優勢在于制備簡單、成本低廉、操作易行、對環境友好，檢測時間短及結果可視化等，但在靈敏度方面還有很大的提高空間。由于分析物通過紙條傳送，局部分析物濃度可能因溶液擴散而減少，而在多重檢測中有些信號分子可能會擴散到鄰近通道[33]，因此還存在交叉污染的可能性，且目前核酸紙條的制備方法仍不成熟，這些因素限制了HIV核酸紙條檢測在市場的應用。

　　4小結與展望

　　艾滋病的早發現早治療依賴于HIV實驗室檢測技術，而在眾多實驗室檢測方法中HIV核酸檢測窗口期短，靈敏度高，對艾滋病的早期診斷、病程檢測、抗病毒治療效果評價和耐藥性檢測等非常重要，但由于HIV基因存在多樣性，且高度變異，很難設計一套引物能夠覆蓋所有的HIV序列，因此檢測的靈敏度受到限制[34]，現有的HIV檢測方法或是操作復雜、對實驗人員要求較高或是儀器及試劑較為昂貴，檢測成本較高，既難以在一般的PCR實驗室推廣，也不適合對大量病人的現場快速檢測，難以實現廣泛的臨床應用。通過對當前HIV核酸檢測的現狀分析可以發現，未來HIV核酸檢測的發展目標是進一步縮短檢測窗口期，提高檢測靈敏度、特異性，降低漏檢率，開發出檢測速度快，操作簡單方便的檢測方法、試劑或儀器，且能夠降低檢測成本，使其能夠滿足基層醫療單位及欠發達地區艾滋病檢測實際工作的需要。微流控芯片技術能將樣本制備、核酸提取、擴增和檢測各個部分進行整合，自動化操作完成全過程，具有液體流動可控、試劑消耗量小和分析速度快的特點[35-36]，將在未來HIV核酸檢測中發揮重要的作用。

　　《HIV核酸檢測技術應用現狀》來源：《中國艾滋病性病》，作者：張雅 卓之豪 張師音