摘要：為了控制和測定枸杞葉的黃酮含量，建立HPLC測定蘆丁的方法。采用PhnomenexC18（2.5×150mm），流動相為甲醇，0.1%磷酸水，流速1.0ml/min，檢測波長為254nm,外標法定量。結果表明該方法穩定，枸杞葉蘆丁含量9月份達到最高，8月份的含量次之。
　　關鍵詞：枸杞葉；黃酮；HLPC
　　枸杞葉，又稱為天精草，為常用的傳統中藥，其有效成分主要為黃酮類化合物[1]。研究發現黃酮類成分具有止咳、平喘、祛痰之功效，并能擴張冠狀動脈及降低血膽固醇，有增強心臟收縮、減少心臟搏動數及明顯的抗氧化等作用[2-5]。供試枸杞葉分別于5月、6月、7月、8月、9月和10月中旬采自青海省都蘭的同一批枸杞枝條，海拔3800m，經盧學峰和梅麗娟兩位高級工程師鑒定為寧夏枸杞(LyciumbarbarumL.)。全株自然陰干，粉碎后備用。
　　1、儀器與設備
　　1.1儀器：美國Agilent1200型高效液相色譜儀[四元梯度泵，DAD檢測器，Agilent1200色譜工作站]；AG204電子分析天平；KQ2250DB型數控超聲提取儀；RT29型中藥粉碎機；超純水機。
　　1.2試劑：色譜用甲醇為色譜純；純凈水為18.25兆歐的超純水；提取用甲醇，H3PO4均為分析純。蘆丁對照品購自中國藥品生物制品檢定所,純度大于98%。
　　2、方法與結果
　　2.1色譜條件：色譜條件為PhnomenexC18（2.5×150mm）柱，流速為1.0ml/min，柱溫為25℃，檢測波長254nm，流動相A為甲醇，B為0.1％磷酸溶液，0-20min，45%A；20-30min，45A-65％A。標準品及樣品色譜圖分別見圖1。
　　
　　圖1a供試溶液的色譜圖b蘆丁對照品的色譜圖
　　2.2對照品溶液的制備：分別精密稱取經五氧化二磷干燥過夜的蘆丁對照品7.0mg，溶解于10ml的容量瓶中，既得0.7mg/ml的溶液，搖勻，0.45μm的微孔濾膜過濾后作為對照品溶液。
　　2.3供試溶液的制備：不同時間采集的枸杞葉樣品各取約1g，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇25mL，超聲提取20分鐘，過濾，定容至50ml的容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，既得。
　　2.4標準曲線及線性范圍：精密吸取對照品溶液2，4，6，8，10μL，在2.1項色譜條件下依次進樣，以進樣量(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標繪制標準曲線,得蘆丁的線性回歸方程：Y=2454.632X-32.12，r=0.9999。
　　2.5穩定性試驗：取枸杞葉按照2.3項下方法配制成溶液,分別在0、3、6、9、12h后在上述色譜條件下進樣，結果蘆丁的面積RSD為0.81%，表明樣品在12小時內穩定。
　　2.6精密度試驗：取2.5項下枸杞葉溶液，連續進樣5次，結果槲皮素的峰面積的RSD為0.84%，說明該實驗的精密度良好。
　　2.7重復性試驗：精密稱取枸杞葉樣品1共5份，每份1.0g，分別按照2.3項下方法配成溶液，精密吸取10μL進樣分析，蘆丁的峰面積RSD為1.53%(n=5)，說明該方法重復性較好。
　　2.8加樣回收率試驗：精密稱取已知蘆丁含量的枸杞葉藥材5份，每份1.0g，加入對照品溶液，制備樣品溶液。精密吸取10μL進樣分析，計算平均加樣回收率，結果見表1。
　　表1加樣回收率
　　測定成分 樣品含量（mg/g） 加入量（mg） 測得量/（mg/g） 回收率（%） RSD（%）
　　蘆丁 1.2 1 2.17 98.6% 1.6
　　2.9樣品含量測定：分別精密吸取樣品溶液和混合對照品各10μL，注入高效液相色譜儀中，按2.1項下色譜條件測定，測定峰面積積分值，按外標法計算樣品溶液中蘆丁含量，結果見表2。
　　表2不同月份黃酮含量
　　月份 黃酮含量（mg/g）
　　5 1.2
　　6 1.4
　　7 1.8
　　8 3.0
　　9 3.2
　　10 2.5
　　3、討論
　　考慮了甲醇、乙醇作為溶媒進行提取溶劑的選擇(無水乙醇、60%甲醇、80%甲醇、甲醇)，并對不同提取時間(20，30，40min)和不同提取方法(超聲、回流及微波)進行比較，結果顯示甲醇20min超聲提取效率最高，且槲皮素和山奈酚測得含量高。
　　
　　圖3不同月份枸杞葉蘆丁含量變化
　　從圖3可以看出隨著枸杞葉采集月份不同，其蘆丁含量呈明顯的先增加后減弱的趨勢，而且9月份枸杞葉的蘆丁含量最高，這為枸杞葉的采摘提供了理論基礎。即該類地區枸杞葉自4月底、5月初出芽后，持續生長約至10月便會變黃脫落，繼而新發第二批葉片，因此，采自9月中旬的枸杞葉，其中次生代謝物的含量積累量達到一個新的高度。通過對不同采收期枸杞葉中蘆丁含量的動態變化規律研究可以為枸杞葉藥材的產地選擇及最佳采收期的確立提供一定的數據參考，也為進一步開發枸杞葉的藥用功能和擴大黃酮類藥物的藥源提供一定的依據。
　　參考文獻
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　　[2]張穎，張立睦，周紅英，等．不同產地枸杞子中黃酮含量的測定[J]．中國中醫藥科技，2004，11(2)：102-103．
　　[3]李國莉，黃元慶．寧夏枸杞不同組分黃酮含量分析[J]．寧夏醫學院學報，1995，17(2)：114-115．
　　[4]苑可武，孟憲惠，徐文豪．銀杏葉中黃酮含量的季節性變化[J]．中草藥，1997，28(4)：211-212．
　　[5]施榮富，王春紅，李永海．沙棘葉黃酮含量及變化規律研究[J]．國際沙棘研究與開發，2003，1(1)：40-44．
　　作者簡介：吳桂玲，女，1983年生，青海樂都人，碩士研究生，助理研究員，主要從事農產品分析檢測工作。