結(jié)核病是由結(jié)核桿菌感染引起的慢性傳染病。結(jié)核菌可能侵入人體全身各種器官，但主要侵犯肺臟，稱為肺結(jié)核病。本文主要針對(duì)結(jié)核病血清診斷中HSP65的應(yīng)用前景進(jìn)行了一些分析，文章是一篇研究生論文范文。

　　[摘要] 目的通過評(píng)價(jià)HSP65抗原表達(dá)在結(jié)核病血清診斷中的效果，分析其應(yīng)用前景。方法取活動(dòng)期結(jié)核病患者63例納入觀察組，選取體檢健康志愿者60例納入對(duì)照組，就HSP65分別與38 kDa、16 kDa、LAM聯(lián)合檢測(cè)診斷對(duì)照組與觀察組結(jié)核病。結(jié)果W estern-hlot結(jié)果顯示，表達(dá)產(chǎn)物在相對(duì)分子量65 kμ處有一條表達(dá)帶，在健康人血清陰性中則無表達(dá)帶;特異度、敏感度與38 kPa基本一致，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論HSP65在結(jié)核病血清診斷中可作為備選標(biāo)志物，反應(yīng)強(qiáng)度與38kDa基本相當(dāng)，聯(lián)合診斷有助于提高診斷符合率;HSP65對(duì)結(jié)核病X線空洞影敏感度較高。

　　[關(guān)鍵詞] 結(jié)核病,結(jié)核分歧桿菌,血清學(xué),HSP65

　　結(jié)核病(tuherculosis，TB)是一種結(jié)核分枝桿菌感染引起的傳染病，全世界每年約有20億人感染結(jié)核分枝桿菌(M.tuherculosis，MTB)，我國TB發(fā)生率、發(fā)病率、病死例均位于世界前列，TB防控形勢(shì)仍不容樂觀。MTB潛伏性是致TB防控效果不佳的主要原因之一，感染者早期常無典型癥狀表現(xiàn)，且難以根除，無癥狀攜帶者對(duì)MTB抗原產(chǎn)生遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)是潛伏期診斷的唯一指標(biāo)。

　　1 資料與方法

　　1.1 一般資料

　　以2013年2月-2014年5月該醫(yī)院收治的所有活動(dòng)期結(jié)核患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床確診，活動(dòng)期患者;②知情同意;③臨床資料完整。入選患者63例納入觀察組，其中男33例、女30例，年齡27～ 64歲，平均(44±14)歲，病程1～8年，平均(1.5±3.2)年，抗酸染色陽性43例、痰細(xì)菌培養(yǎng)陽性52例、PPD皮試陽性35例，X線片結(jié)核空洞影46例。選取體檢健康志愿者60例納入對(duì)照組，其中男31例、女29例，年齡28～64歲，平均( 45±12)歲，未合并有肺部疾病，如肺結(jié)核、肺炎，兩組患者年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

　　1.2 材料與試劑

　　E.coli DH5α、MTB H37Rv株，pPRO EX Hrra原核表達(dá)載體，GCG疫苗株，Takara公司提供。LA Taq DNA聚合酶、Ecor I試劑Takara公司提供，T4連接酶、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒(上海生工生物工程有限公司產(chǎn))，DNA快速純化/回收試劑盒，標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量、HRP-羊抗鼠IgH、HRP-羊抗人IgG，鼠抗MTB HSP65 mAh等。儀器主要包括：TGL.16G高速臺(tái)式離心機(jī)，HERAEYS C02培養(yǎng)箱，法VILBER LOURMAT公司產(chǎn)VILBER凝膠成像儀，SPECORD 40紫外分光光度儀，-70℃超低溫冰箱，倒置顯微鏡，生物安全臺(tái)，醫(yī)用凈化工作臺(tái)，Dy-3D型多功能電泳儀，緊密電子天平，Olymhus公司熒光顯微鏡，SUN公司酶聯(lián)免疫吸附儀等。

　　1.3 方法

　　制備E.coli DH 5α感受態(tài)細(xì)胞。參照GenBank組織標(biāo)準(zhǔn)MTB HSP65編碼，設(shè)計(jì)引物，由北京奧科生物技術(shù)有限公司提供。擴(kuò)增HSP65基因，擴(kuò)增產(chǎn)物行DNA快速純化回收。回收產(chǎn)物與克隆載體，將混合物以熱休克法轉(zhuǎn)化為E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，觀察白色菌落。進(jìn)行重組質(zhì)離酶切鑒定、序列測(cè)定，陽性克隆名為pPRO-hsp65，進(jìn)行鑒定，取鑒定正確的陽性菌行IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后行SDS-PAGE凝膠電泳分析。以Ni-NTA純化試劑盒純化蛋白，離心100 mL誘導(dǎo)菌液，制備樣品，進(jìn)行親和色譜純化，收集洗脫液，以紫外分光光度儀測(cè)定純化蛋白濃度，將洗脫液以置于-20℃恒溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

　　表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分析后，100 V恒壓電轉(zhuǎn)1 h行蛋白電轉(zhuǎn)，后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上、行麗春紅染色，若蛋白電轉(zhuǎn)成功，以蒸餾水洗至褪色，以10 g/L牛血清白蛋白TBST封閉30 min，連續(xù)震蕩洗滌3×5 min，分別以鼠抗MTB HSP65 mAh、觀察組患者血清、對(duì)照組健康人血清結(jié)合1 h，TBST震蕩洗滌3×5 min，加HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG結(jié)合th，TBST震蕩洗滌3×5 min，以O(shè)PD顯色液觀察結(jié)果。同時(shí)，聯(lián)合目前臨床已相對(duì)成熟的38 kDa、16 kDa、LAM抗原血清學(xué)應(yīng)答輔助診斷，將觀察組與對(duì)照組患者血清編號(hào)打亂，觀察組作為“真陽性”、對(duì)照組為“假陽性”，則敏感度=觀察組中檢查出的陽性例數(shù)/真陽性例，特異度=觀察組中檢查出陰性例數(shù)/真陰性例。

　　1.4 統(tǒng)計(jì)方法

　　數(shù)據(jù)以SPSS 13.0軟件處理，計(jì)數(shù)資料以[n(%)]表示，組間比較采用X?檢驗(yàn)。

　　2 結(jié)果

　　2.1 不同抗原表達(dá)血清診斷

　　Western-hlot結(jié)果顯示，表達(dá)產(chǎn)物在相對(duì)分子量65 kμ，處有一條表達(dá)帶。HSP65分別與38 kDa、16 kDa、LAM聯(lián)合檢測(cè)，敏感度、特異度均有不同程度提高，其中與38 kDa聯(lián)合檢測(cè)敏感度、特異度最高，HSP65+38 kDa敏感度高于HSP65，HSP65特異度高于16 kDa，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1

　　抗酸染色、PPD皮試與X線片對(duì)HSP65檢測(cè)影響

　　HSP65血清抗原檢測(cè)正確者X線片結(jié)核空洞影比重高于錯(cuò)誤者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

　　3 討論

　　該次實(shí)驗(yàn)以Ppro EX HTa表達(dá)為載體，行酶切位，高效轉(zhuǎn)錄Trc啟動(dòng)子，以表達(dá)HSP65基因，有利于蛋白的分離純化，且表達(dá)較穩(wěn)定，蛋白生物學(xué)活性保留較好。分離純化HSP65，行血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果，顯示敏感度達(dá)68.75%、特異度達(dá)86.67%，高于LAM、16 kDa，與38 kDa基本持平，后三者均為目前臨床常用的MTB感染血清學(xué)診斷標(biāo)志物，提示HSP65可作為血清學(xué)診斷TB單獨(dú)標(biāo)志物。此外，HSP65+38 kDa敏感度高于HSP65，HSP65特異度高于16 kDa，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示聯(lián)合檢測(cè)可能提高檢測(cè)敏感度，但無法有效提高特異度。關(guān)于LAM、16 kDa、38 kDa血清學(xué)診斷肺結(jié)核研究較少，敏感度在40%～90%之間，如林楠等以4種結(jié)核抗原進(jìn)行結(jié)核病血清學(xué)診斷，單獨(dú)應(yīng)用靈敏度在30.9%～66%，特異度76.2%～90.5%，不同學(xué)者研究結(jié)果存在較大差異，這與不同患者肺結(jié)核嚴(yán)重程度、結(jié)核分枝桿菌活動(dòng)度存在較大差異納入患者標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一有關(guān)，血清學(xué)檢測(cè)運(yùn)用于結(jié)核病診斷敏感度仍較低，大規(guī)模推廣尚需時(shí)日。

　　該次研究表明，HSP65診斷正確者抗酸染色陽性比重、PPD皮試陽性比重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示抗酸染色陽性比重、PPD皮試陽性不能真實(shí)反映MrrB應(yīng)激狀態(tài)。HSP65血清抗原檢測(cè)正確者X線片結(jié)核空洞影比重高于錯(cuò)誤者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示X線片空洞形成與MTB應(yīng)激有關(guān)，提示患者病情已進(jìn)入或?qū)⒁�進(jìn)入活動(dòng)期。劉志輝等對(duì)結(jié)核性胸膜炎患者結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液、胸腔積液和血清蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，結(jié)果顯示濾液、胸液與血清特異性蛋白質(zhì)標(biāo)志物密切相關(guān)，而濾液、胸腔積液與空洞形成有關(guān)。目前，已有血清學(xué)快速診斷肺結(jié)核技術(shù)，孟煒而等以血清腺苷脫氨酶診斷肺結(jié)核敏感度達(dá)94.0%、特異性70.7%，具有較高的應(yīng)用價(jià)值，HSP65在結(jié)核病血清診斷中的應(yīng)用仍有待時(shí)日。

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