硒是哺乳動(dòng)物必需的一種微量元素，缺硒會(huì)導(dǎo)致多種病理狀態(tài). 硒蛋白是微量元素硒發(fā)揮生物學(xué)功能的主要形式. 為了進(jìn)一步探討硒蛋白P在腫瘤中的作用，我們利用免疫組化技術(shù)觀察該抗體在結(jié)腸癌中的表達(dá)。

　　《癌癥》雜志是由中華人民共和國(guó)教育部主管，中山醫(yī)科大學(xué)腫瘤防治中心(世界衛(wèi)生組織癌癥研究合作中心)主辦，美國(guó)LANDES出版社協(xié)辦的核心科技期刊。創(chuàng)刊于1982年2月，月刊，大16開，112頁，進(jìn)口銅版紙彩印，國(guó)內(nèi)外公開發(fā)行。

　　1對(duì)象和方法

　　1.1對(duì)象結(jié)腸癌30例，為第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院普通外科200310/200505手術(shù)切除標(biāo)本,男17例，女13例. 年齡45~79(平均61.4)歲;高分化10例，中分化5例，低分化15例;腫瘤TNM分期：I期8例，II期9例，III期13例. 另取30例原發(fā)器官正常結(jié)腸組織作為對(duì)照.

　　兔抗人硒蛋白P多克隆抗體，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室先期制備保存. 免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉公司.

　　1.2方法① 將組織蠟塊切片，常規(guī)脫臘：70℃烤片2 h，二甲苯10 min×2次. 水化： PBS洗3 min×2次. ② 30 mL/L H2O2溶液室溫處理10 min，雙蒸餾水洗3 min×3次. ③ 在0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)92~98℃水浴中處理25 min修復(fù)抗原，自然冷卻到室溫. 緩沖液洗3min×2次. ④ 分別用正常山羊血清和卵白素室溫封閉2 h. ⑤ 滴加稀釋的一抗SelP多克隆抗體(1∶50)，37℃孵育4 h. PBS洗3 min ×3次. ⑥ 生物素結(jié)合的羊抗兔IgG二抗和ABC復(fù)合物室溫分別孵育2 h. ⑦ 滴加DAB溶液顯色，注意觀察顏色變化，及時(shí)終止，沖洗. ⑧ 蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，封片.

　　以免疫組化試劑盒中的陽性片作陽性對(duì)照，以0.01 mol/L PBS(pH 7.4)和正常羊血清分別替代一抗和二抗作為陰性對(duì)照. 陽性染色為棕黃色，定位于細(xì)胞胞質(zhì)和細(xì)胞膜. 染色陽性細(xì)胞數(shù)量評(píng)分： 0分(全片未見著色或少于5%細(xì)胞散在著色)，1分(5%~25%細(xì)胞著色)，2分(25%~50%細(xì)胞呈陽性)，3分(50%~75%細(xì)胞染色陽性)，4分(>75%細(xì)胞染色陽性). 染色強(qiáng)度評(píng)分：0分(陰性)，1分(弱陽性)，2分(中等陽性)，3分(強(qiáng)陽性). 染色陽性細(xì)胞數(shù)量評(píng)分與染色強(qiáng)度評(píng)分之積為最終染色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分(陰性)，0~4分(弱表達(dá))，4~8分(中等表達(dá))，8~12分(強(qiáng)表達(dá)).

　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理: 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包，用非參數(shù)檢驗(yàn)，兩個(gè)獨(dú)立樣本W(wǎng)ilcoxon檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析. P<0.05認(rèn)為存在顯著性差異.

　　2結(jié)果

　　2.1硒蛋白P在腫瘤及正常對(duì)照組織中的表達(dá)免疫組化染色結(jié)果見表1.表1硒蛋白P在腫瘤及正常對(duì)照組織中的表達(dá) 陽性信號(hào)為棕褐色或棕黃色，呈彌漫狀或片狀分布. 硒蛋白P染色主要定位于細(xì)胞胞質(zhì)及胞膜中，細(xì)胞外間質(zhì)也有部分染色，而細(xì)胞核無染色.在結(jié)腸癌中硒蛋白P表達(dá)與分化程度有關(guān)，尤其是伴黏液分泌者中低表達(dá)明顯;細(xì)胞富于黏液成分或杯狀細(xì)胞無論是正常還是腫瘤中表達(dá)均為陰性.硒蛋白P在正常對(duì)照組織中的陽性率表達(dá)高于結(jié)腸癌中的表達(dá)(圖1).

　　2.2硒蛋白P在腫瘤中的表達(dá)與其分化程度及臨床分期的關(guān)系見表2.

　　3討論

　　目前硒蛋白P真正的生物學(xué)功能還不清楚，特別是與腫瘤發(fā)生的關(guān)系不甚明了. Burk等[1]認(rèn)為硒蛋白P可能是自由基的清除劑. 硒蛋白P可能由于其抗氧化的保護(hù)性作用，通過消除自由基，減少DNA損傷，預(yù)防突變阻止腫瘤的發(fā)生[2-3]. 其他可能的機(jī)制是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)的抗癌活力;拮抗腫瘤細(xì)胞內(nèi)cGMP的增加，抑制DNA, RNA及蛋白質(zhì)的合成;抑制腫瘤病變中新生血管生成[4-6].

　　A: 結(jié)腸癌組織; B: 正常結(jié)腸組織.

　　圖1硒蛋白P的表達(dá)ABC ×200 表2硒蛋白P在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)與臨床病理學(xué)因素的關(guān)系現(xiàn)認(rèn)為血漿中硒蛋白P水平和腫瘤的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，PerssonMoschos等[7]發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)于硒蛋白P濃度的5個(gè)水平，從低到高，發(fā)生腫瘤的相對(duì)危險(xiǎn)度分別為5.2, 2.3, 2.9, 2.2和1.0，硒蛋白P水平最低組發(fā)生呼吸道和消化道腫瘤的概率分別是硒蛋白P高水平組的6倍和3.4倍，表明隨著硒蛋白P濃度增高，腫瘤發(fā)生的危險(xiǎn)度降低.

　　Mork等[2]發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸腺瘤較鄰近正常黏膜硒蛋白P mRNA表達(dá)下降，并認(rèn)為在結(jié)直腸腺瘤硒蛋白P mRNA表達(dá)下調(diào)可能是腺瘤到腺癌發(fā)展過程中的一個(gè)早期事件，這種下調(diào)使硒蛋白P表達(dá)減少，導(dǎo)致DNA受到氧化損傷，從而發(fā)生基因突變，引起腫瘤的發(fā)生和促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，而且硒蛋白P和同屬硒蛋白的胃腸谷胱甘肽過氧化物酶在抗氧化細(xì)胞抵抗腺瘤腺癌演變中起到互補(bǔ)作用. AlTaie等[3]證實(shí)在結(jié)直腸癌中其mRNA表達(dá)明顯減少或缺失，表明在結(jié)腸癌中可能存在著硒蛋白P基因的突變和轉(zhuǎn)錄異常.

　　本結(jié)果提示，硒蛋白P表達(dá)在結(jié)腸癌與正常組織差異顯著，表達(dá)與分化程度有關(guān). 伴黏液分泌者中低表達(dá)，細(xì)胞富于黏液成分或杯狀細(xì)胞無論是正常還是腫瘤中表達(dá)均為陰性. 或許提示正常腸黏膜杯狀細(xì)胞分泌功能與硒蛋白P表達(dá)無關(guān);同樣，其在結(jié)腸癌中的表達(dá)與腫瘤分期無關(guān). 在結(jié)腸癌硒蛋白P低表達(dá)，除了受硒營(yíng)養(yǎng)狀況(血漿中硒蛋白P濃度)的影響，可能存在著硒蛋白P基因的突變和轉(zhuǎn)錄異常[3]，失去這一保護(hù)性因素，可能導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生.

　　【參考文獻(xiàn)】

　　[1] Burk RF,Hill KE. Regulation of selenoproteins [J]. Annu Rev Nutr, 1993,13:65-81.

　　[2] Mork H, AlTaie OH, Bahr K, et al. Inverse mRNA expression of the selenocysteinecontaining proteins GIGPx and SeP in colorectal adenomas compared with adjacent normal mucosa[J]. Nutr Cancer, 2000,37(1):108-116.

　　[3] AlTaie OH, Uceyler N, Eubner U, et al. Expression profiling and genetic alterations of the selenoproteins GIGPx and SePP in colorectal carcinogenesis[J]. Nutr Cancer, 2004,48(1):6-14.

　　[4] Ganther HE. Selenium metabolism and mechanisms of cancer prevention[J]. Adv Exp Med Biol, 2001,492:119-130.

　　[5] Raich PC, Lu J, Thompson HJ, et al. Selenium in Cancer Prevention:Clinical Issues and Implications[J]. Cancer Invest, 2001,19(5):540-553.

　　[6] Brown KM,Arthur JR.Selenium,selenoproteins and human health:a review[J]. Public Health Nutr, 2001,4(2B):593-599.

　　[7] PerssonMoschos ME, Stavenow L, Akesson B, et al. Selenoprotein P in plasma in relation to cancer morbidity in middleaged Swedish men[J]. Nutr Cancer, 2000,36(1):19-26